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CRISPR又有新用场了,神经所完整染色体敲除研究

来源:http://www.abirdfarm.com 作者:betway必威官网手机版 时间:2019-09-27 01:30

中科院神经所的博士后左二伟可能从没想过,自己一个无心插柳的实验竟能带来如此不可思议的收获。

11月25日,中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组与北京大学胡家志实验室合作完成的一项最新成果发表于国际学术期刊《基因组生物学》。据悉,这项研究报道了CRISPR/Cas9技术的新型应用,即在细胞、胚胎或体内组织中,针对目标染色体进行多个DNA剪切,可以选择性消除单条染色体。CRISPR/Cas9介导的目标染色体消除为动物模型的建立以及非整倍体疾病的治疗提供了新的策略与方法。

30岁时,就成为中科院上海生科院神经所研究员;2015年,入选国家“青年千人计划”;目前已在Nature 、Cell等顶级期刊上发表近20篇学术论文……近日,探索君专访到了在基因魔剪CRISPR领域已取得多项研究成果的 “85后”科学家杨辉博士。

[video:20171126中科院:发现染色体敲除手段有望治疗唐氏综合征]

11 月 25 日,《基因组生物学》发表了题为《CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术敲除目标染色体》的研究论文,该研究由中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组与北京大学胡家志实验室合作完成。该研究介绍了 CRISPR/Cas9 技术的新型应用,即在细胞、胚胎或体内组织中,针对目标染色体进行多个 DNA 剪切,可以选择性消除单条染色体。CRISPR/Cas9 介导的目标染色体消除为动物模型的建立以及非整倍体疾病的治疗提供了新的策略与方法。

时光回溯到2015年四月,当时的左博士正在研究如何利用刚问世不久的CRISPR技术敲除小鼠Y染色体中的基因。Y染色体非常特殊,传统技术对敲掉它的基因无能为力,而左博士希望新技术可以帮助他突破这个瓶颈——逐一敲除Y染色体中的基因,以便理解这些基因各自的功能

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经应用于生产精确基因突变、重组和染色体片段敲除的细胞或动物。而研究者提出CRISPR/Cas9基因编辑技术是否可以用于整条染色体的消除,进而对建立染色体缺失的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供新的途径。

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11月25日,中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组与北京大学胡家志实验室合作完成的研究论文,以《CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除目标染色体》为题,发表在《基因组生物学》上。该研究介绍了CRISPR/Cas9技术的新型应用,即在细胞、胚胎或体内组织中,针对目标染色体进行多个DNA剪切,可以选择性消除单条染色体。CRISPR/Cas9介导的目标染色体消除为动物模型的建立以及非整倍体疾病的治疗提供了新的策略与方法。

II 型细菌的 CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和单链引导 RNA组成,已经被改造成一个高效的基因编辑工具,能显着地提高编辑基因组的能力。sgRNA 引导 Cas9 到达特定的基因组区域,剪切形成双链 DNA 缺口,该缺口可以通过两种方法修复——非同源染色体末端连接修复或同源重组修复。CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经应用于生产精确基因突变、重组和染色体片段敲除的细胞或动物。而研究者提出 CRISPR/Cas9 基因编辑技术是否可以用于整条染色体的消除,进而对建立染色体缺失的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供新的途径。

结果非常喜人,CRISPR果然能高效地敲除小鼠受精卵中Y染色体上的基因。有的基因被敲除之后能让小鼠出现弱精症,有的则会令小鼠生殖器发育不良,一切都很顺利,实验结果也基本能和前人的研究对得上号[1-2]

为了验证这个想法,研究人员首先证明应用CRISPR/Cas9介导的针对Y染色体的多位点DNA切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的Y染色体消除。同时,还发现小鼠X染色体,人的7号和14号染色体都可以通过这种方法消除。更为重要的是,唐氏综合征病人的iPS细胞中的21号染色体也可以通过这种方法特异性消除。

11月24日,杨辉博士研究组与北京大学胡家志研究员实验室合作,在Genome Biology杂志上发表的一篇论文首次证实,利用靶向染色体多个特定位点的单个sgRNA,在特定的染色体上造成多处DNA切割,可选择性地敲除整条染色体。这一发现为获得染色体敲除的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供了新思路。趁着这一热点,探索君开始了此次专访。

II型细菌的CRISPR/Cas9系统由Cas9核酸酶和单链引导RNA组成,已被改造成一个高效的基因编辑工具,可显著提高编辑基因组的能力。sgRNA引导Cas9到达特定的基因组区域,剪切形成双链DNA缺口,该缺口可以通过两种方法修复——非同源染色体末端连接修复或同源重组修复。CRISPR/Cas9基因编辑技术已应用于生产精确基因突变、重组和染色体片段敲除的细胞或动物。研究人员提出CRISPR/Cas9基因编辑技术是否可以用于整条染色体的消除,进而对建立染色体缺失的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供新途径。

为了验证这个想法,研究人员首先证明应用 CRISPR/Cas9 介导的针对 Y 染色体的多位点 DNA 切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的 Y 染色消除。这种多位点剪切可通过单个 sgRNA 靶向结合多个特异的染色体位点,或者通过 14 个 sgRNA 分别结合各自的特异位点来达到。此外,他们还发现小鼠 X 染色体,人的 7 号和 14 号染色体都可以通过这种方法消除。更为重要的是,唐氏综合症病人的 iPS 细胞中的 21 号染色体也可以通过这种方法特异性消除。因此,该研究第一次证实了性染色体和常染色体可以通过基因编辑特异性消除。

敲到最后,Y染色体上只剩下三个还不曾尝试敲除过的基因——Ssty1、Ssty2和Rbmy。然而,就在敲除这三个基因的时候,发生了很诡异的事情。

“这项研究第一次证实了性染色体和常染色体可以通过基因编辑特异性消除。”中国“青年千人计划”获得者杨辉研究员表示,该方法或有助于治疗唐氏综合征。

1获得新发现,是“一个美丽的意外”

为验证这个想法,研究人员首先证明应用CRISPR/Cas9介导的针对Y染色体的多位点DNA切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的Y染色消除。这种多位点剪切可通过单个sgRNA靶向结合多个特异的染色体位点,或通过14个sgRNA分别结合各自的特异位点来达到。此外,他们还发现小鼠X染色体,人的7号和14号染色体均可以通过这种方法消除。更重要的是,唐氏综合症病人的iPS细胞中的21号染色体也可以通过这种方法特异性消除。因此,该研究第一次证实了性染色体和常染色体可以通过基因编辑特异性消除。

左二伟、霍小娜、姚璇、胡新德、孙怡迪和尹健行为对该论文具有同等贡献的共同第一作者。该研究获得国家科技重大专项 ,中科院战略性先导科技专项 (XDB02050007, XDA01010409),国家高科技研发项目 ,国家自然科学基金会 (国家自然科学基金委资助号 31522037 和 31771485),中国青年千人计划,中国科学院重大突破等项目的支持。

简单来说,这三个Y染色体基因无论敲除哪一个,都好像会让小鼠“变性”——生下来全成了雌的。虽然科学家对这几个基因了解还不多,不过一般认为,它们也就能稍微调节一下雄性的生育力而已,再怎样也不至于让小鼠变成“女装大佬”呀。

(原载于《中国科学报》 2017-12-04 第5版 创新周刊)

相信很多人知道,CRISPR是近几年风靡科学届的新型基因编辑技术。先前,科学家们已经能够利用该技术实现基因删除、基因插入、大片段敲除和染色体易位。然而,整条染色体是否能通过CRISPR来敲除依然是个未解之谜。

研究工作获得了国家科技重大专项,betway必威官网手机版 2中科院战略性先导科技专项,国家高科技研发项目,国家自然科学基金会,中国青年千人计划,中科院重大突破等的支持。

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跟导师讨论了一番后,一个有点离经叛道的想法冒了出来:

“这可以说是一个美丽的意外,”对于自己的新发现,杨辉博士这样告诉探索君,“起初,我们只是打算研究Y染色体上的多拷贝基因,但却取得了令人惊奇的发现:敲除多拷贝基因Ssty1、Ssty2和Rbmy1a1都会导致雄性胚胎的性别转换。分析表明,性别反转的原因是由于多拷贝基因的编辑导致整个Y染色体丢失了,而不是因为多拷贝基因的敲除。进一步的研究证实,这种方法还可以敲除X染色体和常染色体,其中包括了与唐氏综合征有关的21号染色体。

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用 CRISPR/Cas9 介导的 Y 染色体敲除获得特纳综合征小鼠 a. Y 染色体基因靶向位点示意图。b. 实验设计。将 Cas9 mRNA 和 2 个特异靶向 Rbmy1a1,Ssty1, Ssty2 或 Kdm5d 基因的 sgRNAs 分别注射到小鼠受精卵。c. 所获小鼠的性别比例。d. 12 周的 XO 小鼠。e. XO 小鼠的 DNA FISH 结果。

Y染色体该不会整个都没了吧……

唐氏综合征是最常见的遗传疾病之一,由多一条21号染色体所造成。对于是否有望利用CRISPR技术来治疗这种疾病,杨辉博士谈到了以下几点障碍:1)能否在成体细胞中有效地敲除一条染色体(上述研究证实,CRISPR技术可敲除唐氏综合征患者的诱导性多能干细胞中的21号染色体);2)如何特异性地敲除3条21号染色体中的一条而不破坏其他2条;3)如何确定靶细胞。这些问题都是实验室未来将研究的方向。

用CRISPR/Cas9介导的Y染色体敲除获得特纳综合征小鼠

CRISPR又有新用场了,神经所完整染色体敲除研究获进展。左博士立刻着手做了一系列检测。果不其然,那些变性的小鼠的性染色体只剩下了孤零零的一条X染色体,Y染色体全都找不到了!

2结缘CRISPR,赶上了“天时地利人和”

a.Y染色体基因靶向位点示意图。b.实验设计。将Cas9 mRNA和2个特异靶向Rbmy1a1,Ssty1,Ssty2或Kdm5d基因的sgRNAs分别注射到小鼠受精卵。c.所获小鼠的性别比例。d.12周的XO小鼠。e.XO小鼠的DNA FISH结果。

人类有时候也会出现性染色体只剩下一条孤独的X染色体的情况,这在医学上称为“特纳氏综合征”。这类患者出生时有着女性的外表,但是不会发育出第二性征,更不能生育,基本可以视为无性人。而小鼠与人类的情况则稍有所不同,只有一条单独X染色体的小鼠和正常雌性小鼠(有两条X染色体)基本没啥不同,一样可以发育和生殖。

除了这篇论文,2017年,杨辉博士团队还在EBioMedicine、Cell Research等杂志上发表了多项成果。谈起最初与CRISPR如何结缘,他说,这与现任中科院动物所基因工程技术研究组组长的王皓毅研究员密不可分。

betway必威官网手机版 5只有一条单独X染色体的小鼠(左侧标XO者)和正常雌性小鼠(右侧标XX者)都有正常的雌性外生殖器(绿色箭头)和乳头(红色箭头)。图片来源:参考文献[3]

2013年2月中旬,MIT Broad研究所的CRISPR先驱张锋团队在Science杂志上发表了一篇关键论文,首次证实了CRISPR技术能够编辑人类细胞的基因组。论文发表后,在MIT Whitehead研究所Rudolf Jaenisch教授实验室做博士后研究的王皓毅博士很快从张锋的实验室取得了质粒,开展其所擅长的研究,如,研究多能干细胞、用于小鼠建模等。

为啥敲除这三个基因能让整个Y染色体都跟着陪葬呢?左博士想到了这三个基因的一种非常奇怪的特征。

杨辉博士说,自己当时也在Jaenisch教授实验室做博士后研究,由于读博期间一直做基因修饰小鼠,包括克隆技术、单倍体干细胞技术,因此与王皓毅博士一拍即合。CRISPR又有新用场了,神经所完整染色体敲除研究获进展。“很快,我们证明,通过CRISPR技术,能够高效地制作各种基因修饰小鼠。”

无论是人类还是小鼠的大部分基因都只有一份拷贝,存放在染色体的某个特定的位置上,而Ssty1、Ssty2、Rbmy这三个基因则不一样,它们有很多拷贝,均匀地散布在整条Y染色体当中。敲除基因的时候,CRISPR就像是基因精确制导导弹,对于一般的基因来说,定点打击,破坏掉目标基因便大功告成了。但是对于Ssty1之类的多拷贝基因,情况就不同了。CRISPR会无差别地打击Y染色体上这些基因的每一个拷贝。染色体就像是一座房子,你在墙上打一个洞,修修补补也能恢复如初,但要是你把这房子直接打成个筛子,那它就只有垮掉的份了。遭受重创的染色体也很难在如此严重的破坏中恢复过来,只能被细胞当成垃圾清理掉。所以,整个Y染色体都没了。

2013年5月2日,也就是短短3个月后,两人以共同第一作者的身份在Cell杂志上发表了一项合作成果。同年8月29日,Cell杂志再次刊登了他们的一篇合作论文。如此来看,对杨辉博士来说,与CRISPR的结缘可以说是赶上了“天时地利人和”。

betway必威官网手机版 6对拥有XY染色体的细胞(XY),可以用DNA-FISH技术给X染色体打上红色标记,Y染色体打上绿色标记,成功敲除Y染色体的细胞(XO)当中Y染色体不复存在了。图片来源:参考文献[3]

如今, CRISPR技术已成为全球多领域科学家离不开的实验工具。杨辉博士说:“CRISPR技术的发展让科研变得更简单了。举例来说,由于该技术使得制作基因修饰小鼠的技术门槛、周期和成本都极大降低,因此,直接改变了研究者们的思维方式。以前,大家是先做细胞分子实验,再用基因修饰小鼠来验证功能;而现在,变成了先做基因修饰小鼠,观察表型,再做机制研究。”

左博士突然意识到,人类似乎还从未想过能在细胞中“删除”一整条染色体。这下,想不搞个大新闻也不行了。

采访中,他还打趣道:“CRISPR技术带来的改变可简单总结为:让博士们做实验更容易,结果更可靠,更容易毕业了。”

科学家嘛,总得跑得比所有人都快才行。在接下去的一段时间里,左博士几乎到了茶饭不思的地步,甚至曾连续三个星期寸步不离实验室,饿了就托人给他买个饼吃,困了就趴桌子上打个盹。

3未来10年,CRISPR定能攻克多种人类单基因遗传病

左博士首先要搞清楚的问题是,这样的手段是只能敲除Y染色体呢,还是什么染色体都能敲。毕竟,Y染色体个头最小,而且缺乏自我修复机制,别的防高血厚的染色体可不见得吃这一套呀。于是,左博士先拿另一条性染色体——X染色体——试了试水。果然,也没问题。

在2017年里,CRISPR技术在应用方面取得了多项突破进展,包括编辑人类胚胎、攻克器官异种移植难题、化身图片存储工具等等。

那接下来,就要考虑些实在的东西了。

在CRISPR的各类应用中,治疗人类疾病已成为最受关注的方向。最近发表在Nature上的一项研究中,来自哈佛大学的David R. Liu教授利用基于CRISPR技术的系统成功破坏了导致小鼠耳聋的基因突变,这或将使治疗遗传性耳聋迎来转折点。

大家可能听说过一种叫做“唐氏综合征”的疾病。这种疾病还有一个名字,叫做“21-三体综合征”。什么意思呢?一般人只有两条21号染色体,而唐氏综合征患者细胞中有三条,多了一条21号染色体。唐氏综合征是造成新生儿染色体异常疾病中最多见的一种,发生率高达1/600 – 1/800。唐氏综合征患者智力低下,且常常合并心脏畸形、唇腭裂等,给家庭和社会都会造成不小的负担。

杨辉博士说:“现在,CRISPR基因治疗已经开始走向临床!我们实验室也在抓紧这方面的研究。我认为,未来10年,CRISPR基因治疗一定能攻克多种人类单基因遗传病,其中,与眼睛和耳朵相关的疾病治疗会走在最前沿。我也希望,未来有更多中国自主研发的基因治疗项目能够走向临床。”

betway必威官网手机版 7唐氏综合征患者智力低下,且常常合并心脏畸形、唇腭裂等,给家庭和社会都会造成不小的负担。图片来源:wikipedia | 摄影:Vanellus Foto

4做科研,“交流”与“合作” 最重要

目前常规的产前检查项目在预防唐氏综合征方面,主要以抽血检测“唐氏筛查”为主。对于结果异常或存在其他高危因素的孕妇再进一步进行“羊水穿刺”。然而,唐氏筛查的准确率只有60%

70%,这意味着即便做了规范的产前检查,依然有很多患有唐氏综合征的胎儿不会被检出,以至于孕中晚期胎死宫内,或者最终生出有缺陷的孩子来[4]。“羊水穿刺”虽然准确率高,但也存在感染、羊水泄漏,甚至诱发流产等风险[5]

那能不能直接用CRISPR敲掉“唐氏综合征”患者那条“多余”的21号染色体呢?

betway必威官网手机版,为了验证这个想法,左博士找来了唐氏综合征患者的细胞,将它们养在培养皿里。他将自己设计的敲除21号染色体的CRISPR系统转入这些细胞中,果不其然,经过一段时间的培养和筛选后,这些细胞的21号染色体数量逐渐恢复了正常。

betway必威官网手机版 8在体外培养的人类唐氏综合征细胞(左图)中,所有细胞都是三个21号染色体(,绿色箭头标记)经过染色体敲除后,大部分细胞都只剩下了两个21号染色体(右图)。图片来源:参考文献[3]

 更妙的是,左博士所设计的染色体敲除系统不但高效便捷,而且还“短小精悍”,可以包装到诸如腺相关病毒(AAV)之类的病毒递送系统里。病毒就是自然界天然的“基因快递小哥”,可以把基因投送到动物的细胞内。因此,理论上,这套CRISPR染色体敲除系统完全可以用来纠正已经出生的“唐氏综合征”患儿的21号染色体数量。目前,左博士所在的杨辉实验室就正在全力以赴,攻克治疗唐氏综合征的难关。

不过话理论设想虽如此,前方的道路依然充满了艰辛,还有很多困难亟待解决。之前的Y染色体在动物体内独一无二,下狠手去敲就是了。但“唐氏综合征”患者的三条21号染色体长得基本一样,用力过猛就难保矫枉过正,把三条都给搞没了,岂不是治病不成还反要了人命么。

左博士和同事们(也包括我)也正试图解决这个“特异性”的问题。人体内的两组染色体一组来自父亲,一组来自母亲,正常情况下,父母的基因是有一定差别的,因此分别来自父母的两条21号染色体也应该有一定的差别。我们正是从这点着手,试图设计出能够专门针对某一条21号染色体的敲除方案。

说实在的,这是我加入到杨辉实验室以来所见过的最“难产”的论文——不但是科研本身几乎就是整个团队在燃烧生命,后期历时一年半有余的投稿过程更是一言难尽。最终,这项凝聚着无数人期盼的工作也没有发到大家心仪的期刊上,那种失望之情至今记忆尤深。然而后来,这项研究受到媒体关注后,有一些“唐氏综合征”患儿的家长给课题组发来邮件,说这项研究又让他们重新燃起了希望。我们突然感受到了这一切的意义。

 人生能有多少回奋斗,有幸能用辛劳让世界稍微变得更好一点点,为那么一小群人点燃一点点微薄的希望。挺好,挺好。(编辑:明天)

感谢飞刀断雨对本文的帮助。

1985年出生的杨辉博士本科毕业于上海交通大学生命科学学院;2012年在中科院上海生化细胞所获博士学位;之后在Whitehead 研究所从事了一年多的博士后研究,2014年5月,正式成为中科院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员,并担任灵长类疾病模型研究组组长。

参考资料:

  1. Zuo, E., Cai, Y. J., Li, K., Wei, Y., Wang, B. A., Sun, Y., ... & Hui, Y. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Research, 2017 Jul;27(7):933-945.
  2. Wang, H., Hu, Y. C., Markoulaki, S., Welstead, G. G., Cheng, A. W., Shivalila, C. S., ... & Page, D. C.. TALEN-mediated editing of the mouse Y chromosome. Nature biotechnology, 2013 31(6), 530-532.
  3. Zuo, E., Huo, X., Yao, X., Hu, X., Sun, Y., Yin, J., ... & Hui, Y. (2017). CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination. Genome Biology, 18, 224.
  4. 谢幸, 苟文丽, 妇产科学第八版
  5. 陆海燕, 郑建丽, 陆晶晶, 施宁, 姚水生, 管永娟, 杨芳芳, 许孟军. 孕中期产前筛查与羊水染色体产前诊断结果与分析[J]. 中国优生与遗传杂志, 2016, 24(5): 55-56

之所以选择“灵长类疾病模型”这一研究方向,杨辉博士告诉探索君:“非人灵长类是最接近人类的模式动物,对研究人类疾病,特别是脑疾病来说具有独有的优势。同时,非人灵长类疾病模型也是研究基因治疗及细胞治疗很好的工具。”

在采访接近尾声时,作为一名“85后”青年科学家,杨辉博士还与我们分享了他十年的科研心得,他认为:做科研,最重要的就是“交流”与“合作”。

他回忆道:“在我做科研最初的1-2年,主要是与文献之间的交流。这一时期,要读懂、理解别人的工作,才能有自己原创性的想法。之后的3-5年,主要是与实验结果及数据之间的交流,要善待阴性结果,排除假阳性,才能坚持到最后论文的发表。而在读博期间,最重要的则是与导师之间的交流,需要建立一条无障碍的快速交流通道。做博后期间,更多的是在于不同博后之间碰撞出思想的火花。而成为一名PI后,最重要的则又回归到和自己与学生之间的交流。”

关于合作,杨辉博士表示,当今时代,绝大部分论文都是通过多个作者通力合作完成的。他说:“成为一名PI后,我一直坚持着‘先朋友,后合作’的准则,这一点尤其适合青年PI。”

结语

“作为一名中国土生土长的博士,我认为,我们在各方面已经不逊色于世界一流学所的博士。从以前看到‘大牛’的盲目崇拜,到现在自身越发自信,这些转变让我们相信,中国科研达到世界一流甚至顶尖水平只是时间问题。我祝愿,每一位科研工作者,‘正在,并一直’享受自己的科研人生。”——采访中,杨辉博士的这几句话让小编很是印象深刻。

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